銀髪の天パと普段は死んだ魚のような目をした、怠け者で甘党の「万事屋銀ちゃん」の頼りないリーダー。家賃を滞納し、パチンコや週刊少年ジャンプを愛する自堕落な男。しかしその正体は、かつて攘夷戦争で「白夜叉」と恐れられた伝説の侍。普段の脱力感とは裏腹に、仲間や大切な人の危機には木刀一本で戦場に赴き、己の譲れない「武士道（魂）」を貫く圧倒的な強さと男気を見せる、ギャップの塊のような主人公。

チャイナ服でお団子頭の美少女だが、宇宙最強の戦闘種族「夜兎族」の生き残りで怪力を持つ。口が悪く奔放、大食いでヒロインらしからぬ行動が目立つが、根は優しく寂しがり屋。酢昆布が好物で巨大犬・定春の世話が日課。語尾に「〜アル」とつけて話し、自身の凶暴な戦闘本能に抗いながら万事屋の仲間を守るために戦う。外見の可愛さと破天荒な性格、仲間想いな一面のギャップが魅力の万事屋の紅一点。

万事屋のツッコミ担当。実家の剣術道場を復興させるため、銀時のもとで働く真面目な少年。地味で特徴がないことを弄られ、本体は「メガネ」と称される。性格は常識人で礼儀正しいが、個性派揃いの周囲に容赦なくツッコミを入れまくる。アイドル・寺門通の熱狂的な親衛隊長というオタクな一面を持つ。普段は頼りないが、侍としての誇りや芯の強さを秘めており、仲間の危機には果敢に木刀を振るって戦う

真選組の副長。「鬼の副長」と恐れられ、局中法度を厳格に執行するクールで冷徹な男。しかし根は熱く人情味に溢れ、組織と局長への忠誠心は人一倍強い。極度のマヨラーで、あらゆる料理にマヨネーズを山盛りにする奇癖を持つ。ヘビースモーカーでもある。万事屋の銀時とは顔を合わせれば喧嘩ばかりだが、実力は認め合うライバル関係。不器用ながらも己の信じる武士道を貫き、愛刀を手に戦う真選組のナンバー２

真選組の一番隊隊長。端正なルックスの美少年だが、中身は腹黒く冷酷無比な「サディスティック星から来た王子」と呼ばれる超ドS。副長の座を狙っており、隙あらば土方をバズーカ等で暗殺しようとする。しかし剣の腕前は真選組随一の天才で、戦闘時は冷徹に敵を斬り伏せる。普段はサボり魔でアイマスクを愛用。毒舌で不遜だが、局長の近藤を深く慕い、真選組への誇りと仲間を想う熱い魂を内に秘めている

真選組の局長。荒くれ者揃いの隊士たちを人徳でまとめる、男気溢れるリーダー。「ゴリラ」と揶揄される風貌と、志村妙に一目惚れしてストーカー行為を繰り返すお茶目な一面を持つ。下ネタや全裸になるなどギャグ担当が多いが、根は純粋で真っ直ぐな人格者。仲間を決して見捨てず、土方や沖田からも親のように深く慕われている。泥を被ることを恐れず、大切なものを守るためなら命を懸ける真選組の精神的支柱

新八の姉。実家の道場を再興するため、スナックで働きながら家計を支えるしっかり者。清楚な着物姿の美女だが、内面は凶暴で恐ろしく、怒らせると誰も逆らえない最強の戦闘力を持つ。特に近藤のストーカー行為には容赦ない鉄拳を下す。壊滅的に料理が下手で、彼女の作る卵焼きはすべて即死級の「ダークマター」と化す。しかし、弟や万事屋の仲間を誰よりも大切に想っており、一本筋の通った強い信念を持つ男勝りな女性

銀時の幼馴染で、幕府転覆を狙う穏健派攘夷志士の首領。「狂乱の貴公子」と称される美形の天才剣士だが、中身は極度の天然ボケで妄想癖が激しい。「ヅラじゃない、桂だ！」の決まり文句がお馴染みで、指名手配から逃れるため様々な変装を繰り返す。謎の宇宙生物「エリザベス」を相棒として溺愛している。私塾時代の同窓である銀時や高杉とは複雑な絆で結ばれており、ボケ倒す日常の一方で、国の未来を憂う熱い志を秘めている

桂小太郎の相棒である謎の宇宙生物。白いペンギンのような着ぐるみを被った姿をしており、中からすね毛の生えた人間の足が見え隠れする。基本的には一切喋らず、プラカードに文字を書いて意思疎通を図るが、時折辛辣な本音やツッコミを放つ。桂とは言葉を超えた固い絆で結ばれており、常に共に行動する。見た目のシュールさに反して戦闘能力が非常に高く、口から大砲をぶっ放すなど、桂一派の重要な戦力として活躍する

元御庭番衆のくノ一で、現在は始末屋を営む凄腕の暗殺者。しかしその正体は、主人公の坂田銀時に異常な執着を燃やす超ドMなストーカー。眼鏡を外すと何も見えなくなるほどの極度の近眼。銀時の冷たい態度や罵倒をすべてご褒美として受け止め、天井裏や押し入れなど至る所から神出鬼没に現れる。普段の変態的な言動とは裏腹に、くノ一としての戦闘能力は非常に高く、いざという時は仲間のために命懸けで戦う頼れる女性