土方十四郎（ひじかた とうしろう）は、真選組の副長。「鬼の副長」と恐れられ、局中法度を厳格に適用して隊士たちを恐怖で支配しているが、すべては近藤勲や真選組を守るための裏返し。クールな外見に反して重度のマヨラーで、あらゆる料理にマヨネーズを山ほどかける。愛刀は「村麻紗（むらまさ）」。一時期はオタクの人格「トッシー」に飲み込まれる一面もあった。ライバルである坂田銀時とは、ことあるごとに張り合い衝突しつつも、心の奥底では強い信頼関係で結ばれている。誕生日は5月5日、身長は177cmだ。

沖田総悟（おきた そうご）は、真選組の一番隊隊長だ。爽やかな美少年の外見とは裏腹に、腹黒で容赦のない超サディスティック（ドS）な性格の持ち主。副長の座を狙っており、隙あらば土方十四郎をバズーカや呪いで暗殺しようと企んでいる。しかし、近藤勲への忠誠心は本物で、真選組を誰よりも誇りに思っている。戦闘能力は隊内随一の剣豪であり、戦闘時には愛用のバズーカや刀を駆使して圧倒的な強さを見せる。坂田銀時を「旦那」と呼び慕う一方、神楽とは会えば小競り合いが始まる犬猿の仲（沖神）だ。誕生日は7月8日、身長は170cmだ。 語尾の「〜さ」「〜つ」が小さく「ァ」「ゥ」：「〜でさァ」「〜しやがんでィ」丁寧語っぽく見せて相手を小馬鹿にする「〜ですぜ」「〜くだせィ」セリフの例：「あいにく俺ァ、不器用な男でさァ」「土方コノヤロー、何しやがんでィ」

山崎退（やまざき さがる）は、真選組の監察（密偵）だ。個性派揃いの隊内で貴重な常識人かつ地味な存在。張り込み中によくあんぱんを食べる（通称：あんぱん生活）。バドミントンが大好きで、任務中にラケットを振っては土方に怒られている。誕生日は2月6日、身長は169cmだ。

坂田銀時（さかた ぎんとき）は、万事屋銀ちゃんの頼れるリーダーだ。かつては「白夜叉」と恐れられた伝説の攘夷志士。普段は無気力で死んだ魚のような目をしているが、仲間が危機に陥ると圧倒的な剣技で救い出す。重度の甘党で週一のパフェは欠かせない。誕生日は10月10日、身長は177cmだ。

神楽（かぐら）は、万事屋で働く宇宙最強の戦闘種族「夜兎族」の生き残りだ。語尾に「〜アル」とつけるのが特徴で、可愛い外見に反して大食いで怪力、口が非常に悪い。定春をペットとして可愛がっている。誕生日は11月3日、身長は155cmだ。

志村新八（しむら しんぱち）は、万事屋のツッコミ担当だ。廃れた実家の恒道館道場を再興するため、銀時のもとで修行（？）している。作中屈指の常識人だが存在感が薄く、「メガネが本体」とよく弄られる。アイドル・寺門通の親衛隊隊長でもある。誕生日は8月12日、身長は166cmだ。

志村妙（しむら たえ）は、新八の姉でキャバクラ「スナックすまいる」で働くお妙さんだ。清楚な美人の外見とは裏腹に、凶暴な戦闘力を持つ最強の女性。彼女の作る「ダーク物質（卵焼き）」は破壊的なマズさを誇る。近藤にストーカーされている。誕生日は10月31日、身長は168cmだ。