スパイダーマン。 スパイダーマンに変身する際は、赤と青が混ざったスーツとマスクを着用する。 ファンの多いヒーローだが、その素顔は誰も知らない。 性格は優しく、時に感情に振り回されることもある。 『ノー・ウェイ・ホーム』から4年が経過したピーター。ドクター・ストレンジの呪文によって世界からパーカーという人間の記憶が消え、MJやネッドもピーターのことを覚えていない。 そのため、今作のピーターは以前よりもずっと孤独で自立しており、ニューヨークでの犯罪阻止にほとんどの時間を費やしながら一人で生きている。 しかし、体に異変が現れ始め、クモの能力が不安定になり、攻撃性が強まるという問題が生じる。

フランク・キャッスル。 ジョン・バーンサル演じるフランク・キャッスルが再びパニッシャーとして登場する。 スパイダーマンとは犯罪者への対処法が根本的に異なるため、度々口論になる。 ピーターが人々を救うヒーローに近い存在なら、フランクはより荒っぽく冷徹な方法で犯罪と戦うキャラクターだ。 過去に家族を失っており、決して感情に流されることはない。 「過ちを犯した奴は死ぬべきだ」という信条を持っており、言動のほとんどが荒々しい。

ミシェル・ジョーンズ。 ピーターが最も愛した人だが、彼女の中にピーターの記憶はない。 今作でのMJは単なる恋人役ではなく、ピーターに自身の人生を振り返らせる重要な人物となる。 ピーターはMJと再び親しくなりたいと願っているが、自分が誰であるかをすぐに明かせない状況のため、初対面のように関係を築き直さなければならない。 聡明だが、時折突飛な一面を見せる。

ピーターの親友だったネッド。 彼もまたピーターのことを覚えていない。しかし、物語の中で再びピーターと関わることになり、持ち前の科学技術能力を駆使してスパイダーマンを追跡できる装置を作り上げる。 そしてこの装置が、物語の終盤で非常に意味深な役割を果たすことになる。 ひょうきんな性格の持ち主だ。

ダメージ・コントロール局（DODC）を率いている。 表向きは超能力関連の事件を処理する研究室やオフィスのように見える。巨大で清潔な政府機関だが、地下ではミュータントを対象とした危険な研究や実験が行われている。世間ではビル・メッツガーを悪く言う者はいない。 ジーン・グレイの家族など、超能力を自分の望む人間に与えたり奪ったりするために、危険な研究を強行する。

セイディー・シンク演じる人物。物語の後半でMCU版のジーン・グレイであることが判明する。 つまり、ついにMCUにおいてミュータントやX-MENへと繋がる設定が本格的に登場し始めたことを意味する。 ジーンは非常に強力なテレパシー能力を持っており、他人の精神や肉体に影響を与えることができる。 最初は単なるヴィランのように見えるが、実際には家族であるサラを救うという目的を持っていた。