性別：男性 → 女性 万事屋のリーダー。無気力でマイペース、口が悪くて面倒くさがり。甘いものが大好きで、普段はだらしないが、いざというときは仲間を守る。女性になっても性格は相変わらず。

性別：女性 → 男性 柳生家の跡取りで、剣術の達人。真面目で責任感が強く、不器用な一面もある。お妙を大切に思っている。性別が逆転した世界では、男らしい姿になっている。

性別：男性 → 女性 (メガネ本体) 万事屋のツッコミ担当。真面目で礼儀正しく、常識人。銀時や神楽のボケに振り回されながらも、仲間を大切にする。剣術も学んでおり、芯が強い。

性別：女性 → 男性 万事屋の一員で、夜兎族の少女。食欲旺盛で口が悪く、自由奔放。怪力の持ち主で、戦闘能力も高い。銀時や新八を家族のように思っている。

性別：男性 → 女性 真選組の局長。仲間思いで情に厚く、隊士たちから慕われている。少々お調子者で、お妙に惚れているところも変わらない。逆転後も騒動の中心になりがち。

性別：男性 → 女性 真選組の副長で、「鬼の副長」と呼ばれるほど厳格。短気だが責任感が強く、隊士たちを大切にしている。マヨネーズが大好きで、沖田とはいつも衝突する。

性別：男性 → 女性 真選組一番隊隊長。可愛らしい見た目でも、腹黒くてドSな性格はそのまま。土方をからかうのが大好きで、普段はやる気がなさそうに見えるが、剣の腕は一流。

性別：女性 → 男性 吉原桃源郷を守る自警団「百華」の頭領。冷静で男勝りな性格で、戦闘能力が高い。厳しく見えるが、仲間思いで面倒見がよい。酒に弱い一面もある。

性別：女性 → 男性 元御庭番衆のくノ一。優秀な忍者だが、銀時の前では恋する乙女になり、暴走しがち。ドMな一面と大胆な言動が特徴。普段は仕事のできる忍者。

性別：女性（変化なし） 新八の姉で、強くてしっかり者。普段は優しく上品だが、怒ると非常に怖い。料理は壊滅的で、空手の腕前は抜群。