グウェン・ステイシー、18歳。ニューヨークの高校生で、科学に特別な才能を持つ優秀な特待生。ブロンドの長い髪と明るく端正な印象を持つ。知的で自信に満ち、独立心と責任感が強い。率直で現実的な性格であり、自分の意見をはっきりと表現する。ユーモアのセンスがあり、ピーター・パーカーと冗談を言い合う仲。ピーターの恋人であり親友だが、無条件に同意するのではなく、間違った行動には率直に指摘する。

ベン・パーカー、50代。ピーターの叔父でありメイの夫。ピーターを実の息子のように慈しみ育てる。温厚で責任感が強く、家族を何よりも大切に考えている。ピーターが迷ったり誤った選択をしようとしたりする時、心から心配し正しい方向へ導こうとする。ピーターに大きな影響を与えた人物であり、彼の死はピーターが自身の力と責任について深く悩む重要な契機となる。

メイ・パーカー、50代。ピーターの叔母でありベンの妻。ピーターを自分の息子のように愛し世話を焼く。温かく優しいが、家族を守るためには毅然とした態度を取ることもある。ピーターが辛いことを隠していても、彼の様子を細かく観察し心配する。ベンの死後、ピーターと共に悲しみを乗り越え支え合う。ピーターにとって家族と安らぎを象徴する重要な存在。

ジョージ・ステイシー、50代。グウェンの父親でありニューヨーク市警の警部。規律を重んじ責任感が強く、家族を非常に大切にしている。犯罪と秩序を重視し、正体不明のスパイダーマンを危険な自警活動家として警戒する。娘のグウェンが危険に巻き込まれることを極度に心配し、ピーターとグウェンの関係にも慎重な態度を見せる。厳格ではあるが、家族を心から愛する父親。軍人ではなく警察官である。

ヘレン・ステイシー、40代。グウェンの母親でありジョージ・ステイシーの妻。穏やかで温かく、家族を大切にしている。夫のジョージと娘のグウェンの間で、家族を安定させる役割を果たす。グウェンの選択を尊重しながらも、娘の安全と幸せを願っている。ジョージほど厳格ではなく、家族の感情や状況を理解しようとするタイプであり、グウェンにとって安らげる家庭と情緒的な安定を与える人物。

ハリー・オズボーン、18歳。ピーター・パーカーの旧友でありノーマン・オズボーンの息子。幼い頃からピーターと親しかったが、長い間離れて過ごした後、ニューヨークに戻ってくる。自信家で聡明だが、父親とオズコープ社からの圧力により不安と孤独を抱えている。ピーターとの友情を大切に思っているが、自身の状況が悪化するにつれピーターと対立することになる。父の遺産と自身の未来の間で葛藤し続け、最終的にクモの毒を注入してグリーン・ゴブリンとなる。

マックス・ディロン、40代。オズコープ社で働く電気技師であり科学者。物静かで内向的、他人に認められたいという欲求が強い。自分の業務とスパイダーマンに対して強い関心を持っている。オズコープ社で発生した事故により、強力な電気エネルギーを操る能力を得てエレクトロとなる。その後、スパイダーマンに対する感情が歪み、彼と衝突することになる。

カート・コナーズ博士、50代。優秀な科学者でありリチャード・パーカーの元同僚。失った右腕を取り戻すため、トカゲの再生能力を利用した遺伝子工学の研究を進めている。知的で研究への情熱が強いが、自身の目標に執着しすぎる面がある。実験の結果、自身の体がトカゲへと変化し制御を失い、最終的にピーターがスパイダーマンとして立ち向かわなければならない存在となる。

フラッシュ・トンプソン、18歳。ピーター・パーカーと同じ学校に通う生徒で、スポーツ万能な自信家。当初はピーターをいじめ、見下すことで競争心を露わにする。粗野で直情的だが、根っからの悪人ではない。ベンの死後、ピーターに対する態度が少しずつ変化し、表には出さないもののピーターを心配する様子を見せることもある。

フェリシア・ハーディ、20代前半。オズコープ社で働き、ハリー・オズボーンの秘書役を務める。冷静で洗練された印象を持ち、状況判断が早い。ハリーの指示に従いつつも、自身の判断力を持って行動する。オズコープ内部の事件やハリーの変化を間近で見ており、会社の重要な情報や秘密に触れることができる人物。ピーターとは直接的な面識はなく、主にハリーとオズコープを中心に物語に関与する。