E-1：赤羽 業（カルマ） / クラス最強の戦闘力と天才的な頭脳を持つドS少年。E-2：磯貝 悠馬 / 男子学級委員。貧乏だがイケメンで誠実な、クラスの精神的支柱。E-3：岡島 大河 / 変態。エロ本への情熱を暗殺や情報収集に活かす。E-4：岡野 ひなた / 元体操部。驚異的な身体能力を持つアクロバット暗殺者。E-5：奥田 愛美 / 科学の天才。内気だが、毒薬や薬品の調合で暗殺をサポートする。E-6：片岡 メグ / 女子学級委員。男勝りで面倒見が良く、水泳や運動が得意。E-7：茅野 カエデ / 渚の相棒。実は物語の鍵を握る「ある秘密」を隠している。E-8：神崎 有希子 / クラスのマドンナ。清楚に見えて、実はゲーセンの達人。E-9：木村 正義（ジャスティス） / クラス一の俊足を誇る、隠密・偵察のスペシャリスト。E-10：倉橋 陽菜乃 / 生き物大好きな癒やし系。昆虫や自然の知識が豊富。E-11：潮田 渚 / 本作の主人公。小柄で目立たないが、純粋な「暗殺の才能」を秘める。E-12：菅谷 創介 / 芸術肌。変装マスクの作成や、迷彩塗装などの美術担当。E-13：杉野 友人 / 元野球部。気さくな性格で、野球の球速を活かした暗殺を狙う。E-14：竹林 孝太郎 / メガネのオタク。情報分析が得意で、のちに実家の病院を継ぐ。後半（出席番号15〜28）E-15：千葉 龍之介 / 前髪で目が隠れた少年。遠距離スナイパーの男子エース。E-16：寺坂 竜馬 / 大柄な不良グループのリーダー。荒っぽいが、いざという時頼れる。E-17：中村 莉桜 / 英語が得意なギャル風女子。カルマと気が合う悪ガキ。E-18：狭間 綺羅々 / 読書好きでネガティブ。呪いやオカルトを好む陰気な少女。E-19：速水 凛香 / ツンデレな少女。高い動体視力を持つスナイパーの女子エース。E-20：原 寿美鈴 / ぽっちゃり体型。お母さんのような包容力があり、料理が得意。E-21：不破 優月 / 少年漫画マニア。漫画の知識を活かして、事件やトリックを見破る。E-22：前原 陽斗 / クラス一のモテ男でプレイボーイ。磯貝とは親友。E-23：三村 航輝 / 目立たないが、動画編集やディレクション能力が高い。E-24：村松 拓哉 / 寺坂グループ。実家がラーメン屋で、料理の腕を磨いていく。E-25：矢田 桃花 / 抜群のプロポーションを持ち、交渉術（ハニートラップ）を学ぶ。E-26：吉田 大成 / 寺坂グループ。実家がバイク屋で、機械の改造や運転が得意。E-27：律（自律思考固定砲台） / 人工知能（AI）の編入生。アプリとして生徒のスマホに常駐。E-28：堀部 イトナ / 触手を持つ転校生。のちに触手を捨て、工学の才能を活かす。

殺せんせー / マッハ20で動く謎のタコ型超生物。命を狙われながら生徒を育てる名教師。烏間 惟臣 / 防衛省のエリート。真面目で頼れる体育教師として、実践的な暗殺術を指導。ビッチ先生 / 美人な凄腕ハニートラップ暗殺者。生徒に生きた英語と交渉術を教える。雪村 あぐり / 殺せんせーの前の担任。故人であり、物語のすべての引き金となった人物。鷹岡 明 / 防衛省から来た臨時教官。笑顔の裏で暴力支配を目論んだ狂気のサディスト。

鷹岡明: 恐怖で生徒を支配する元防衛省の男。2代目死神: 世界最高峰の殺し屋。のちに触手生物に改造される。プロ集団: 沖縄編で治療薬を人質に生徒を襲った暗殺者たち。シロ 正体：殺せんせーを生み出したマッドサイエンティスト元凶：過去に人体実験で殺せんせーを怪物に変え、すべての歪みを生み出した人物執念：殺せんせーへの強い憎しみから、イトナや2代目死神を操り何度も襲撃