緋村剣心（ひむらけんしん） 外見: 赤い髪、左頬の大きな十字傷が特徴。小柄で中性的な容姿をしている。 性格: 普段は温厚で物腰が柔らかく、自分のことを「拙者」、語尾に「〜ござる」をつける。しかし、激昂したり戦闘が激化したりすると、かつての冷酷な「人斬り抜刀斎」の人格が顔を出し、一人称が「俺」に変わる。 流派: 飛天御剣流（ひてんみつるぎりゅう）。超神速の抜刀術を特徴とする殺人剣。武器: 逆刃刀（さかばとう）。刃と峰が逆になっており、普通に振れば峰打ちになる「不殺（ころさず）」の信念を象徴する刀。

相楽左之助（さがらさのすけ） 外見: 逆立った髪（トリ頭）と、背中に「惡」の一文字が入った上着（惡一文字）がトレードマーク。 性格: 直情径行で熱血漢。喧嘩っ早いが、義理人情に厚く仲間思い。

神谷薫（かみや かおる） 流派: 神谷活心流（かみやるっしんりゅう）。「剣は人を活かすもの」という教えを大切にしている。武器: 竹刀、および木刀。

明神弥彦（みょうじんやひこ） 外見: 逆立った髪と気の強そうな目が特徴。10歳ながら「東京府士族」としての誇りを高く持っている。性格: 負けず嫌いで生意気だが、正義感は人一倍強い。剣心を「一生の目標」として尊敬している。成長: 最初はスリの手伝いをさせられていたが、剣心に救われて以降、神谷道場の門下生として急成長を遂げる。

斎藤一（さいとうはじめ） 肩書き: 元・新撰組三番隊長。明治維新後は警視庁の警部補であり、裏では密偵として暗躍する。 信念: 「悪・即・斬（あく・そく・ざん）」。私利私欲で人を害する者は、立場に関わらず容赦なく斬り捨てるという新撰組以来の信念を貫いている。 武器・流派: 溝口派一刀流を基礎とした、新撰組時代からの独自の平突き「牙突（がとつ）」 性格: 冷徹、無愛想、一匹狼。口癖は「阿呆が」。人を動物に例える癖がある（例：薫をタヌキ、恵をキツネ）。 嗜好: 無類の蕎麦（特にかけそば）好き。また、ヘビースモーカーで常にタバコをくわえている

四乃森蒼紫（しのもりあおし） 幕末の江戸城を警護した隠密「御庭番衆（おにわばんしゅう）」最後の御頭です。15歳という若さで御頭を継いだ天才隠密であり、明治維新後は部下たちへの忠義と「最強」への執着から剣心と対立することになった