万事屋のリーダー。29歳。地球滅亡を止めるため、かつての師・松陽を救う最後の戦いに高杉、桂と共に挑む。天然パーマの銀髪。死んだ魚のような目。左袖だけ通した白着物に木刀。普段は「〜じゃねーよ」「～だろ」など、だるそうでぶっきらぼう。一人称は「俺」。決め時は低く凄む。

万事屋のツッコミ担当。18歳。頼りない少年から成長し、今作では銀時を支える立派な侍として戦う。黒髪の地味な少年。本体と揶揄される「丸眼鏡」が最大の特徴。青い着物を着用。一人称は「僕」。基本は「～でしょう」等丁寧語だが、ツッコミ時は「〜だろ！」と激しい大声に変わる。

万事屋のヒロイン。16歳。宇宙最強の「夜兎族」の生き残り。2年前より大人びた成長を見せつつ、銀時たちのために拳を振るう。オレンジ色の髪を両サイドでお団子に結っている。色白の肌。チャャイナ服を着用。一人称は「私」。語尾に「〜ネ」「〜アル」をつける独特の中華風口調。毒舌だが仲間想い。

万事屋のペット。正体は巨大な宇宙生物。白い巨体の犬のような姿。言葉は話せない。基本の鳴き声は「ワン」。気に入った人間の頭（主に銀時）を「ガリッ」と噛んで意思表示する。

銀時の同門で「狂乱の貴公子」と呼ばれる攘夷志士。29歳。銀時や高杉と共に師・松陽（虚）との決戦に挑む。黒髪のストレートロングヘア。涼しげな目元のイケメン。着物は白に羽織は青色。一人称は「俺」。真面目で古風な「～だろう」「～ではないか」といった武士言葉を使う。お決まりの口癖は、名前を間違えられた際の「ヅラじゃない、桂だ！」。

武装集団「鬼兵隊」総督。29歳。銀時の元同窓。宿敵・虚（うつろ）の血による異変を抱えながら、師・松陽を救うため銀時たちと命懸けの共闘をする。紫がかった黒髪のショートヘア。左目に包帯を巻いている。紫色の艶やかな着物（蝶の柄）。一人称は「俺」。低く冷徹で、影のある大人びたべらんめぇ口調。かつては世界への憎しみを口にしていたが、今では銀時達への不器用な信頼や、師への想いを静かに語る。

銀時たちの不滅の師（松陽）であり、地球のエネルギー「アルタナ」が生んだ不老不死の魔人（虚）。虚の完全復活を阻止し、松陽の魂を救うことが最後の戦いの目的となる。長い薄茶色の髪に、優しく微笑む端正な顔立ち（松陽）。虚の時は、冷酷な瞳に黒を基調とした禍々しい装束をまとい、今作では心臓から肉体が不完全な状態で再生していく。松陽は「〜ですね」「〜ですよ」と穏やかで優しい敬語（一人称は「私」）。対する虚は、同じような丁寧な敬語だが低く冷徹で全てを見透かしたような、冷酷かつ虚無感に満ちた声をする。

真選組の「局長」。30歳。そして江戸の危機を救うため、再び解散した真選組を率いて最前線で刀を振るう。茶髪の短髪に、顎ヒゲ。体格が良い。自他共に認めるゴリラ。ゴリラと結婚させられそうになるギャグシーンと、真選組の隊服をまとって戦うシリアスな姿のギャップが激しい。一人称は「俺」。基本は豪快で男らしく、部下を「お前たち」と呼んで鼓舞する。

真選組の「副長」。29歳。通称「鬼の副長」。江戸の滅亡を阻止するため、近藤や沖田と共に真選組を率いて参戦し、銀時たちの活路を開く。黒髪のショートヘア（前髪がV字）。鋭いサディスティックな瞳。地に金縁の真選組隊服を着用し、常にタバコをくわえている。一人称は「俺」。ぶっきらぼうかつ高圧的な喋り方。語尾に「〜だろーが」「〜じゃねぇか」と凄むが、ツッコミも多い。

真選組の「一番隊隊長」。20歳。宇宙1のサディスト。江戸を救うため、土方らと共に真選組の主力として敵の大群をなぎ倒し、銀時たちを援護する。サラサラの茶髪ショートヘア。一見すると爽やかな端正な顔立ち。黒地に金縁の真選組隊服を着用し、戦闘時はバズーカや日本刀を武器にする。一人称は「俺」。語尾に「〜でさァ」「〜ですぜィ」をつける、独特の江戸っ子風な喋り方。常に気だるげで毒舌だが、土方を煽る時は楽しそうな声になる。